原創(chuàng) 肖百龍 返樸

要充分信任自己的學(xué)生、博士后，給予他們充分的時間和環(huán)境去大膽嘗試。

受訪 | 肖百龍（清華大學(xué)藥學(xué)院教授）

采訪 | Idobon

2021年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎頒發(fā)給了美國生理學(xué)家David Julius與亞美尼亞裔美國神經(jīng)科學(xué)家Ardem Patapoutian，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了溫度覺和觸覺的受體（“for their discoveries of receptors for temperature and touch”）。神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域再次受到學(xué)界和大眾的高度關(guān)注。

其中，Ardem實驗室首次鑒定了哺乳動物中感受機械力的陽離子通道Piezo家族，并發(fā)現(xiàn)它們在觸覺、本體感知等方面的重要作用。當(dāng)時，清華大學(xué)藥學(xué)院教授肖百龍正在美國斯克利普斯研究所（The Scripps Research Institute）跟隨Ardem Patapoutian教授從事神經(jīng)科學(xué)博士后研究，見證并參與了這項偉大的科學(xué)發(fā)現(xiàn)?！斗禈恪吩陬C獎后的第一時間采訪到肖教授，請他為我們講述Piezo蛋白背后的科研故事和將來的探索方向。

返樸：您在Aderm 實驗室做博后期間，見證了Piezo蛋白的發(fā)現(xiàn)?？梢越榻B一下這個發(fā)現(xiàn)背后的故事嗎？

肖百龍：2007年，我到Ardem實驗室做博后，那時他們正在做溫度門控的離子通道，也就是溫度的分子受體的鑒定發(fā)現(xiàn)與研究。他們已經(jīng)報道了幾個溫度感知的分子受體，有感受涼爽的離子通道TRPM8，感知溫?zé)岬腡RPV3和感知冷的TRPA1。當(dāng)時Ardem還是副教授，實驗室充滿活力，感覺很有前景，我也因此選擇了加入這個實驗室，做一些與溫度感知相關(guān)的工作。

那時，隨著TRP家族的發(fā)現(xiàn)，溫度感知已經(jīng)取得很多突破。但在感知領(lǐng)域還有個大家都很關(guān)注的、非常重要的問題還沒有解決：是什么蛋白分子介導(dǎo)了機械力的感知？換言之，觸覺系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)還是未解之謎。當(dāng)時領(lǐng)域內(nèi)許多實驗室，包括David Julius 實驗室，都在尋找這個蛋白分子。

但機械力感知的研究很困難，沒有高通量的篩選方法，只能用電生理技術(shù)對單個細(xì)胞施加機械力刺激，讓它產(chǎn)生電流，來尋找相關(guān)的分子。這個技術(shù)非常有難度，實驗室還沒有人專門投入到機械力敏感離子通道的篩選工作上。到了2007年下半年，Ardem實驗室招收了一個博士后叫Bertrand Coste。Bertrand在法國接受了三年的博士訓(xùn)練，主要工作就是記錄背根神經(jīng)節(jié)的機械敏感電流，有非常扎實的電生理技術(shù)，和Ardem的需求非常匹配。

Bertrand篩選離子通道的策略是：

1. 先篩選細(xì)胞系，看哪些細(xì)胞系會產(chǎn)生機械敏感的電流。他發(fā)現(xiàn)N2A細(xì)胞能響應(yīng)機械力，產(chǎn)生內(nèi)向電流。

2. 然后利用RNA profiling技術(shù)，找到N2A細(xì)胞中高表達(dá)的膜蛋白（兩次跨膜以上）編碼基因，共確定了500多個候選基因。

3. 接著便是對這些基因逐一敲低（knock down）。這是一項高度重復(fù)的艱苦工作，最終在第72個候選基因上，找到了決定N2A細(xì)胞機械敏感電流的基因，F(xiàn)AM38a。后來根據(jù)希臘語，將這個蛋白命名為“Piezo”，意思是壓力。

Piezo蛋白的電生理篩選過程示意。用黑色針頭戳細(xì)胞膜（施加機械力刺激），在另一側(cè)用玻璃電極記錄細(xì)胞膜上的電流變化。細(xì)胞膜受力后，Piezo通道打開，陽離子流入細(xì)胞，玻璃電極即可記錄到內(nèi)流電流。Bertrand Coste先用這一方法找到了Piezo1，又根據(jù)序列同源比對找到了Piezo2。丨來源：https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2021/press-release/

Bertrand大概花了三年時間，成功找到了感受機械力的蛋白，要總結(jié)一些成功要素的話，最重要的是他的電生理訓(xùn)練非常扎實，實驗工作非常嚴(yán)謹(jǐn)。但回頭來看其實也有一定的運氣成分。一方面，根據(jù)篩選策略，Piezo蛋白在N2A細(xì)胞里是高表達(dá)，而在對照組細(xì)胞C2C12細(xì)胞里應(yīng)該是低表達(dá)，但實際情況并不符合設(shè)想的模式。實際情況是Piezo蛋白——我們后來知道是Piezo1——在C2C12細(xì)胞里的表達(dá)比N2A細(xì)胞中更高。另一方面，有500多個備選基因，Bertrand能在第72個就找到，實屬幸運。如果目標(biāo)在后面，那可能就要花五六年的時間去找，很難說能否堅持下去。

返樸：三年找一個蛋白，Bertrand想必壓力很大。當(dāng)時他是怎么應(yīng)對的呢？Ardem作為導(dǎo)師又是什么態(tài)度呢？

肖百龍：Bertrand在這個課題進(jìn)展過程中的確承受著很大壓力。當(dāng)時我的課題是鑒定一個新的溫度感知受體，有了一定進(jìn)展，那時候Bertrand還沒鑒定出Piezo，我們就討論可以一起合作研究這個新型的溫度受體，這樣萬一鑒定工作不順利，Bertrand也能有論文，對他的職業(yè)生涯有幫助。但一段時間后，Bertrand成功篩選到了Piezo1。后續(xù)的實驗證實，敲低Piezo1可以使N2A細(xì)胞喪失感知機械力的能力，而且在其他對力不敏感的細(xì)胞——比如HEK293T細(xì)胞中——過表達(dá)Piezo1，能使HEK293T細(xì)胞獲得機械敏感性。這就完全證實了他的發(fā)現(xiàn)：Piezo1基因是編碼介導(dǎo)機械敏感陽離子電流的必要與充分組成成分。

這個發(fā)現(xiàn)出來以后，Bertrand, Ardem以及實驗室成員都很興奮，大家都意識到這是一個非常重要的突破，整個實驗室也從溫度受體迅速轉(zhuǎn)向，投入到Piezo的研究中。

Ardem的實驗室環(huán)境總體是非常寬松友好，大家效率也很高，壓力主要來自我們自己。而Ardem則非常包容，給大家足夠的信任，讓大家自由探索。我從Ardem身上也學(xué)到了這一點，要充分信任自己的學(xué)生、博士后，給予他們充分的時間和環(huán)境去大膽嘗試。當(dāng)然，Ardem實驗室主要都是經(jīng)過良好學(xué)術(shù)訓(xùn)練的博士后，大家有足夠的學(xué)術(shù)積累和技術(shù)特長去主導(dǎo)自己的課題。

返樸：Piezo蛋白和我們的健康究竟有哪些關(guān)系？

肖百龍：Piezo家族有兩個成員，一個是Piezo1，一個是Piezo2。Piezo2直接和我們的觸覺感知相關(guān)。正常人的撫摸、擁抱、使用各種工具，比如觸摸手機屏幕，都需要Piezo2的參與。還有“本體覺”，就是我們自身的肌肉狀態(tài)，比如走路時保持平衡，是因為神經(jīng)系統(tǒng)中的Piezo2能監(jiān)測到肌肉的整張度。另外，我們的內(nèi)臟器官的機械變化，譬如血壓、呼吸、膀胱充盈度等也被Piezo2所監(jiān)控。

已有非常明確的遺傳學(xué)證據(jù)表明，如果Piezo2突變或者缺失，會引發(fā)明顯的觸覺缺陷，病人對震動、觸碰的敏感性會顯著降低。另外，本體感覺能力會受到很大影響，例如，蒙住病人的眼睛，屏蔽視覺信息，病人就走不穩(wěn)路，摸東西也摸不準(zhǔn)。甚至還會導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)變形，例如，脊柱中正是因為兩側(cè)肌肉牽拉，張力平衡，而缺失Piezo2的病人無法感受肌肉張力，兩側(cè)肌肉就會失去穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致脊柱發(fā)生嚴(yán)重的彎曲、變形。還有，病人會因為不能感知膀胱充盈度而出現(xiàn)泌尿異常。

Piezo2介導(dǎo)了觸覺的感知，在人的機械痛、排尿、呼吸、血壓、骨骼重塑等生理過程中起著重要作用。來源丨h(huán)ttps://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2021/press-release/

Piezo1的表達(dá)就很廣泛了。比如心血管系統(tǒng)，Piezo1在血管內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞上都有表達(dá)，起著很重要的作用。有一種疾病就是由Piezo1功能太強導(dǎo)致的，會造成紅細(xì)胞變形，令其攜帶氧氣的功能發(fā)生紊亂，造成貧血。而Piezo1缺失則會導(dǎo)致淋巴管水腫、胚胎流產(chǎn)等癥狀。

我們自己的工作發(fā)現(xiàn)，Piezo1在心肌細(xì)胞里表達(dá)，參與感知心臟收縮舒張所產(chǎn)生的劇烈機械變化，從而調(diào)控心臟穩(wěn)態(tài)；心臟病患者的Piezo1表達(dá)會出現(xiàn)上調(diào)。我們與合作者還發(fā)現(xiàn)，Piezo1對骨的生成和重塑非常重要。長期臥床或在太空失重會導(dǎo)致嚴(yán)重骨質(zhì)丟失，而骨骼之所以能感受到重力，是因為成骨細(xì)胞中表達(dá)了Piezo1。當(dāng)我們從小鼠中敲除Piezo1，小鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)丟失；而骨質(zhì)丟失病人的體內(nèi)，Piezo1表達(dá)下調(diào)了。

返樸：也就是說，雖然這次諾獎的發(fā)獎理由使用的“touch”這個詞，媒體報道為觸覺，但其實“touch”并不是簡單的“手摸到了什么東西”，它其實非常廣泛，甚至是每個細(xì)胞對力的感知，可以這么說嗎？

肖百龍：對！從力學(xué)的角度來說，只要有接觸就會有力的產(chǎn)生，因此只要有接觸就會造成力的感知，這個感知很有可能就是通過Piezo通道來介導(dǎo)的。Piezo2主要和觸覺、本體覺、內(nèi)臟覺機械力感知相關(guān)，而Piezo1則在機體的很多細(xì)胞組織中都存在。有研究發(fā)現(xiàn)它在癌細(xì)胞里也有表達(dá)，對癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移起著重要作用，因為癌細(xì)胞的遷移也會涉及到力的感知。從這個角度來說，Piezo通道的功能非常廣泛，因而也是無比重要的。

返樸：您在Ardem 實驗室參與了Piezo最初的重要工作，成為獨立PI后，又做出了很多推動性成果，可以介紹下您和其他實驗室在Piezo領(lǐng)域的重要成果嗎？

肖百龍：2010年Ardem實驗室在Science上報道了Piezo蛋白介導(dǎo)機械力感知以后，就有很多后續(xù)問題等待解決。這個基因編碼的蛋白非常獨特，有2500個氨基酸，預(yù)測有30~40次跨膜，是人類蛋白中跨膜次數(shù)最多的一類膜蛋白，而且與已知的其他電壓門控離子通道——例如鈣通道、鈉通道、鉀通道或溫度敏感TRP通道（譬如這次獲獎的另一主角TRPV1）——沒有任何序列上的類似性。因此2010年的這篇文章只能下結(jié)論說Piezo是力感知器的重要組成部分，但不能確定它是直接感受機械力的成孔離子通道。畢竟還存在著另外一種可能性，Piezo蛋白可能是成孔亞基的輔助亞基，賦予機械敏感性。

為了解決這個問題，Bertrand和我展開了合作。我在博士期間做過蘭尼堿受體（Ryanodine receptors）的生化、結(jié)構(gòu)、功能研究，對大型膜蛋白有很好的研究背景。于是我第一個把Piezo1蛋白重組表達(dá)純化出來，證明它形成多聚體，并組裝在脂雙層上。我們發(fā)現(xiàn)在沒有其他任何細(xì)胞成分的人工膜環(huán)境下也能記錄到陽離子電流存在，證實了Piezo1是一類全新的感受機械力的離子通道。這篇文章2012年發(fā)表在Nature上，我和Bertrand是共同一作。這就是我早期在Ardem實驗室參與的工作。

Piezo通道這類全新機械門控離子通道家族的發(fā)現(xiàn)和確立帶來了很多契機。一方面，需要證明它的病理、生理功能的重要性，通過在小鼠、果蠅、斑馬魚等模式動物上敲除這個基因，看看會發(fā)生什么表型改變。另一方面，這個離子通道在分子機制上是怎么工作的？換言之：Piezo通道蛋白怎么將機械力刺激轉(zhuǎn)化為離子的選擇性通透、轉(zhuǎn)化為電信號？這是一個核心問題。

2013年1月，我在清華組建了自己的課題組。

我們知道2013年程亦凡和David Julius合作用冷凍電鏡解析了TRPV1的原子分辨率的結(jié)構(gòu)，而Piezo蛋白是一個非常復(fù)雜的全新蛋白，如果不了解它的結(jié)構(gòu)，要去研究它的機制會非常困難。因此我決定改變研究范式，先獲得結(jié)構(gòu)，再做功能機制研究，這樣會更加高效。基于我自己的研究背景、利用在哺乳動物細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞里重組表達(dá)，我們拿到了純化的Piezo1蛋白。當(dāng)時恰逢清華在建立冷凍電鏡平臺，我們實驗室最初與高寧、楊茂君合作，之后與李雪明課題組長期合作，取得了Piezo1蛋白的中等分辨率和接近原子級別的高分辨率結(jié)構(gòu)(Nature 2015, Nature 2018)，建立了它同源三聚體、螺旋槳狀的結(jié)構(gòu)，搞清楚了離子通道最核心的孔道區(qū)在什么地方，與機械力感覺相關(guān)的結(jié)構(gòu)域等。

在我們于2015年報導(dǎo)了Piezo1的首個中等分辨率結(jié)構(gòu)后，我們實驗室（與李雪明實驗室合作）、Ardem實驗室和Roderick MacKinnon（2003諾貝爾化學(xué)獎得主——記者注）實驗室大約在同一時間解析出了Peizo1蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)。我們和Ardem的文章背靠背發(fā)表在Nature上，MacKinnon則發(fā)在eLife上。

相比Peizo1的結(jié)構(gòu)研究，Peizo2的分子生化更難。我們和李雪明課題組合作，首次、唯一報道了Peizo2的完整結(jié)構(gòu)，確定了它的每個亞基包含38個跨膜區(qū)的完整拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。這為我們研究Peizo2離子通道、感受機械力的分子機制提供了重要的線索。據(jù)此，我們進(jìn)一步開展了大量的基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的結(jié)構(gòu)功能研究，揭示了Piezo通道的離子通透、機械門控的分子機制。

Piezo2的蛋白結(jié)構(gòu)圖。丨供圖：肖百龍

除了分子機制方面的研究，還有藥物工具分子的篩選發(fā)現(xiàn)。由于Piezo是全新的離子通道家族，因此與溫度敏感離子通道TRPV1以及其他電壓門控離子通道相比起來，它的藥物工具非常匱乏。Ardem通過高質(zhì)量的篩選，篩選到了一個小分子Yoda1；我們在清華也做了自己的篩選，篩選出兩個藥物小分子Jedi1/2，能夠激活Piezo1，我們也進(jìn)一步研究了這些小分子藥物的激活機制。

目前看來，在生理病例功能方面，Ardem實驗室做了大量重要的發(fā)現(xiàn)，而在分子機制方面我們實驗室做出了重要的貢獻(xiàn)。

返樸：大家對Piezo家族已經(jīng)取得很多認(rèn)識，下一步重要的待解決問題是什么？還有哪些重要的工作要做？

肖百龍：我認(rèn)為有三個方面。第一，Piezo通道怎么把機械力轉(zhuǎn)成電信號，這個核心問題還沒有完全解決。現(xiàn)在已經(jīng)有一些進(jìn)展，但還處于假說階段，還需要更多結(jié)構(gòu)功能方面的研究。例如，我們現(xiàn)在拿到的還只是Piezo通道在關(guān)閉狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，那它到底是怎樣在受力以后變成開放狀態(tài)的呢？這中間的動態(tài)的過程是怎樣的？其實，包括TRPV1，到底是怎么感知溫度引起通道開放的，現(xiàn)在也還是沒有解決的問題。而TRPV1從1997發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已有20多年了，這個核心問題一直還沒有解決。

第二，Piezo通道現(xiàn)在已經(jīng)被報道具有非常廣泛的生理病理功能。但是絕大多數(shù)的工作都是在敲除體系下的表型描述，具體Piezo到底是怎樣利用它的機械敏感性、離子信號，來調(diào)控相關(guān)的生理病理功能，都還有待更深入的研究。

第三，針對Piezo通道的藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)?，F(xiàn)在已經(jīng)明確Piezo2和觸摸超敏痛密切相關(guān)，且Piezo2的表達(dá)集中在外周感覺神經(jīng)元，那么針對Piezo2的藥物設(shè)計有著非常大的前景。但是由于Piezo通道分子生化研究的困難性，藥物研發(fā)方面還有待突破，這也是我們實驗室的一個長期研究目標(biāo)。

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原標(biāo)題：《肖百龍解讀諾貝爾獎：Piezo的發(fā)現(xiàn)故事和未解之謎》

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