撰稿 | Blair（西湖大學(xué)，博士生）

構(gòu)象改變對(duì)生物大分子（名詞解釋>）功能的正確表達(dá)至關(guān)重要。

補(bǔ)充（來源維基百科）：在分子生物學(xué)里，一個(gè)蛋白質(zhì)可能為了執(zhí)行新的功能而改變?nèi)バ螤?；每一種可能的形狀被稱為構(gòu)象，而在其之間的轉(zhuǎn)變即稱為構(gòu)象改變(英文：Conformational change）它通常會(huì)改變蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，而此結(jié)構(gòu)正好是決定蛋白質(zhì)功能的重要結(jié)構(gòu)。構(gòu)象改變可能是由許多不同的因素所造成的，如溫度、配體蛋白和受體蛋白的鍵結(jié)等。

基于時(shí)間分辨光譜（名詞解釋>）的X射線晶體學(xué)（名詞解釋>）是近年來出現(xiàn)的一種非常成功的生物分子結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，能夠準(zhǔn)確探測(cè)、記錄生物大分子的構(gòu)象變化，為生物、化學(xué)的研究提供重要的參考。

時(shí)間分辨X射線衍射方法（名詞解釋>）由于具有生物分子分辨率高、可在室溫下進(jìn)行、衍射成像效率高等突出優(yōu)點(diǎn)，近年來已經(jīng)逐漸成為生物大分子研究不可或缺的重要工具。

鑒于此，來自瑞典哥德堡大學(xué)的研究人員以“Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography”為題在Science上發(fā)表綜述文章。

得益于近年來X射線自由電子激光（名詞解釋>）的飛速發(fā)展，X射線生物大分子的時(shí)域和空域成像也因此取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。在這篇綜述中，來自瑞典斯德哥爾摩大學(xué)的科學(xué)家系統(tǒng)地總結(jié)了X射線自由電子激光對(duì)生物大分子成像所帶來的變革性影響，詳細(xì)闡述了該成像方法在飛秒時(shí)間尺度上卓越的分辨能力，并對(duì)時(shí)間分辨X射線晶體學(xué)未來應(yīng)用過程中面臨的挑戰(zhàn)、潛在的前景做了充分的討論與展望。

圖1：光敏蛋白的時(shí)間分辨串行晶體學(xué)研究的示意圖 （圖源：Science 373, 980 (2021)）

在同步輻射（名詞解釋>）上使用多色x射線脈沖（Laue衍射）的數(shù)十年工作奠定了時(shí)間分辨大分子晶體學(xué)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。光驅(qū)動(dòng)的生物反應(yīng)可以使用短激光脈沖在整個(gè)晶體中快速啟動(dòng)，因此成為該領(lǐng)域的一個(gè)主要焦點(diǎn)。

10年前，研究人員在X射線自由電子激光器上首次實(shí)現(xiàn)了串行晶體學(xué)（SFX）（名詞解釋>）。在這種方法中，X射線衍射數(shù)據(jù)是從一系列微晶中收集的，這些微晶的最大尺寸通常小于10μm，然后將來自數(shù)千個(gè)微晶的X射線衍射數(shù)據(jù)合并成一個(gè)完整的數(shù)據(jù)集。X射線自由電子激光串行晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)的樣品輸送最初依賴于液體微射流，但此后發(fā)展了許多其他樣品輸送技術(shù)，每種技術(shù)都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)。串行晶體學(xué)克服了限制時(shí)間分辨勞厄衍射的許多技術(shù)限制，從而推動(dòng)了時(shí)間分辨大分子晶體學(xué)的發(fā)展。

同步加速器和X射線自由電子激光

當(dāng)電子發(fā)生振蕩時(shí)，它們發(fā)出電磁輻射。在大型X射線用戶設(shè)施中，電子束被加速到相對(duì)論能量，并通過在陣列內(nèi)以相反方向排列的周期性磁鐵陣列（波蕩器）（如圖2）。這些交變磁場(chǎng)使得通過的電子發(fā)生振蕩，從而產(chǎn)生X射線。

圖2：X射線光源示意圖。(A) 同步輻射光源 (B) X射線自由電子輻射光源 （圖源：Science 373, 980 (2021)）

同步加速器是圓周通常為500到1400米的圓形機(jī)器，其中的波蕩器長(zhǎng)度一般小于5米的。由700到3400米長(zhǎng)的直線加速器將電子引導(dǎo)到50到150米長(zhǎng)的波蕩器中，從而產(chǎn)生X射線自由電子激光。直線加速器產(chǎn)生的電子束比同步加速器（持續(xù)時(shí)間約100ps）要緊密得多（持續(xù)時(shí)間約10fs），因此X射線自由電子激光脈沖要短幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

X射線自由電子激光使用的較長(zhǎng)波蕩器有助于反饋機(jī)制，即波蕩器早期產(chǎn)生的X射線與電子束相互作用，從而產(chǎn)生相干激光過程。激光產(chǎn)生的X射線光子多出許多數(shù)量級(jí)，在1?波長(zhǎng)下工作的X射線自由電子激光通?？梢詾橛脩魧?shí)驗(yàn)提供每脈沖1011到1012個(gè)X射線光子。

對(duì)于大分子晶體學(xué)研究，通過使用微射流在聚焦的X射線自由電子激光光束上連續(xù)注入微米大小的晶體（微晶），可以解決樣品可能被探測(cè)光源破壞的問題。以X射線自由電子激光光源的重復(fù)頻率讀取衍射數(shù)據(jù)，并將大量微晶的數(shù)據(jù)合并在一起就能夠重建出完整的衍射數(shù)據(jù)。因?yàn)閿?shù)據(jù)是使用持續(xù)數(shù)飛秒的X射線自由電子激光脈沖以串行方式收集的，所以這種方法被稱為串行飛秒晶體學(xué)。

盡管歷史上第一批串行飛秒晶體學(xué)結(jié)構(gòu)分辨率并不高，但一旦將X射線波長(zhǎng)接近1?的實(shí)驗(yàn)站投入運(yùn)行，該方法就可以迅速擴(kuò)展到高分辨率成像。

串行飛秒晶體學(xué)

結(jié)構(gòu)生物學(xué)家和同步輻射裝置之間長(zhǎng)達(dá)50年的合作凸顯了X射線源及其使用者之間的相互依賴性。11年前，由直線加速器相干光源（LCLS）首次實(shí)現(xiàn)的1.5?波長(zhǎng)的X射線自由電子激光，對(duì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的生物大分子成像產(chǎn)生了顛覆性的影響。

X射線自由電子激光是一種革命性的光源，因?yàn)樗试S極短而強(qiáng)烈的X射線脈沖聚焦在非常小的樣本上，從而促進(jìn)了許多科學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。

模擬預(yù)測(cè)，生物樣品的原子會(huì)在X射線自由電子激光暴露過程中電離，樣品會(huì)被破壞，但如果X射線自由電子激光脈沖在樣品爆炸之前通過樣品，則可恢復(fù)可解釋的衍射數(shù)據(jù)。這一想法后來被稱為“破壞前的衍射”，通過觀察蛋白質(zhì)晶體在70到300 fs（1 fs=10）的X射線自由電子激光脈沖下衍射功率如何下降，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一想法?持續(xù)時(shí)間為15秒。

時(shí)間分辨串行飛秒晶體學(xué)

串行晶體學(xué)解決了許多限制時(shí)間分辨勞厄衍射（名詞解釋>）更廣泛應(yīng)用的技術(shù)障礙。由于微晶不斷被替換（圖3），串行晶體學(xué)完全消除了研究系統(tǒng)必須返回其靜止?fàn)顟B(tài)以循環(huán)數(shù)據(jù)收集協(xié)議的約束。通過使用準(zhǔn)單色X射線自由電子激光脈沖，也巧妙避免了勞厄衍射易受到晶體雜質(zhì)、錯(cuò)位等缺陷干擾的缺點(diǎn)該脈沖的光子能量帶寬通常約為X射線光子能量的0.1%，幾乎比同步加速器源勞厄衍射研究中常用的范圍窄兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖3：光激發(fā)和多光子途徑示意圖 （圖源：Science 373, 980 (2021)）

同時(shí)，由于X射線自由電子激光光源中的大的逐點(diǎn)能量和光譜波動(dòng)、微晶質(zhì)量的變化、晶體取向的隨機(jī)取樣，在使用這些數(shù)據(jù)時(shí)出現(xiàn)了新的挑戰(zhàn)，在飛秒曝光期間，晶體沒有時(shí)間旋轉(zhuǎn)，因此只能收集部分衍射強(qiáng)度。時(shí)間分辨串行飛秒晶體學(xué)的一個(gè)里程碑式演示使用光敏黃蛋白（PYP）（名詞解釋>）微晶對(duì)使用X射線自由電子激光輻射測(cè)量的光誘導(dǎo)電子密度變化與早期時(shí)間分辨勞厄衍射研究進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試。

圖4：基于差分傅里葉電子密度圖得到蛋白質(zhì)空間構(gòu)型的演化圖像 （圖源：Science 373, 980 (2021)）

與使用較大晶體進(jìn)行的勞厄衍射研究相比，微晶較低的光密度允許獲得較高比例的光激發(fā)PYP，并且這種方法提高了觀察到的電子密度變化的質(zhì)量。雖然單個(gè)衍射強(qiáng)度測(cè)量之間的實(shí)驗(yàn)波動(dòng)較大，但這種噪聲可以通過合并大量微晶的衍射數(shù)據(jù)來減小。在實(shí)驗(yàn)中，利用10000到50000張經(jīng)過處理的衍射圖像就可以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的差分傅里葉電子密度圖。

展望未來

自從七年前首次根據(jù)時(shí)間分辨串行飛秒晶體的數(shù)據(jù)計(jì)算得出高質(zhì)量差分傅里葉電子密度圖以來，這一里程碑大大促進(jìn)了隨時(shí)間變化的大分子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化的研究。時(shí)間分辨串行飛秒晶體學(xué)還開辟了超快結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，對(duì)可視化蛋白質(zhì)構(gòu)象變化過程的研究產(chǎn)生了革命性的推動(dòng)作用。

預(yù)計(jì)在不遠(yuǎn)的未來，這些進(jìn)展將使該領(lǐng)域超越了研究光敏蛋白質(zhì)的限制，并為闡明多種酶的結(jié)構(gòu)機(jī)制提供了可能。鑒于目前的發(fā)展，我們相信時(shí)間分辨X射線衍射和新興的單粒子冷凍電子顯微鏡方法，將會(huì)迅速發(fā)展大生物分子研究的重要實(shí)驗(yàn)方法，從而為活細(xì)胞的化學(xué)反應(yīng)提供全新的研究工具。

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參考資料：

1. G. Br?ndén, R. Neutze, “Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography”, Science 373, 980 (2021), DOI: 10.1126/science.aba0954

2. The Royal Institution, Understanding Crystallography - Part 1: From Proteins to Crystals, Youtube

3. SLAC National Accelerator Laboratory, X-ray Laser Animated Fly-through, Youtube

監(jiān)制 | 趙陽

編輯 | 趙唯

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