1997年2月，英國Roslin研究所伊恩?維爾穆特（Ian Wilmut）教授率領(lǐng)的團(tuán)隊在頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》（Science）公布了“多莉”羊的誕生。這只實(shí)際上出生于1996年5月的首例體細(xì)胞克隆哺乳動物自此成為動物界的“明星”，也徹底顛覆了人類對生殖發(fā)育經(jīng)典理論的認(rèn)識。

“多莉”誕生22年之后，和人類最為接近的靈長類動物食蟹猴的克隆體誕生。這一次，突破性成果發(fā)生地是中國。中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)、蒲慕明領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊為最先誕生的這兩只克隆猴取名為“中中”和“華華”。

該項(xiàng)成果歷時5年，相關(guān)論文則于1月25日以封面文章的形式發(fā)表在《細(xì)胞》（Cell）雜志。罕見的是，論文從投稿到接收甚至歷時不到一個月。這或許一定程度上反映了蒲慕明等人希望在世界范圍內(nèi)占據(jù)“克隆猴”優(yōu)勢的急切，“中國只比國外領(lǐng)先一年”，蒲慕明如此提及。

中國科學(xué)院院士季維智在接受澎湃新聞（m.nxos.com.cn）采訪時同樣表示，“克隆猴的出現(xiàn)確實(shí)只是一個時間問題?！?/p>

季維智是靈長類動物研究領(lǐng)域的權(quán)威，現(xiàn)任昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院院長。上世紀(jì)90年代末，季維智在全球最頂級的非人靈長類研究機(jī)構(gòu)——美國俄勒岡國家靈長類研究中心做訪問學(xué)者。

當(dāng)然，這并不是意味著“克隆猴”能夠輕易完成，而是二十余年時間里久未出現(xiàn)進(jìn)展的克隆技術(shù)在2014年終于有所突破，科學(xué)家對“克隆”的干預(yù)逐漸找到方向，一定程度上提高了克隆效率。

值得一提的是，在中國首創(chuàng)“克隆猴”之際，外界會聯(lián)想到該領(lǐng)域曾經(jīng)的領(lǐng)跑者美國——為何美國沒能成功？答案是，2000年之后，美國科學(xué)界對克隆猴由“雄心勃勃”轉(zhuǎn)為近乎 “偃旗息鼓”。分水嶺之一是美國匹茲堡大學(xué)Gerald Schatten教授彼時的結(jié)論：基于“多莉”的克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)克隆猴是“行不通的”。Schatten此前經(jīng)過6年嘗試，其團(tuán)隊使用了724個猴卵，只培育出33個胚胎，最終無一成活。

美國“克隆猴”逐漸偃旗息鼓，并將研究的重心轉(zhuǎn)向以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)，但大洋彼岸的中國科學(xué)家卻沒有停下腳步?！耙粋€是實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的問題，另一個是集中精力的問題，所以由中國創(chuàng)造了目前這個結(jié)果是很自然的?！奔揪S智表示。

 “克隆猴”技術(shù)難點(diǎn)

“多莉”誕生至今已有超過20種哺乳動物實(shí)現(xiàn)克隆，其技術(shù)均為體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，簡稱“SCNT”）。該技術(shù)原理并不復(fù)雜，研究人員將一種體細(xì)胞培養(yǎng)后注入去除遺傳物質(zhì)的卵子，通過人工方法激活后再移植到代孕母體發(fā)育成個體。

而克隆的核心在于，如何讓已經(jīng)高度分化的體細(xì)胞重新變回分化前的狀態(tài)，這種類似“時光逆轉(zhuǎn)”的反自然過程被稱為“重編程”。季維智提到，“克隆難點(diǎn)就在于體細(xì)胞，科學(xué)家要解決的一個基本的科學(xué)問題就是，如何把高度分化的細(xì)胞變成多能性，具備像精子一樣的功能?！?/p>

長期從事克隆研究的中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究員、世界首例基因編輯克隆犬“龍龍”的培育者賴良學(xué)在接受澎湃新聞（m.nxos.com.cn）采訪時表示，“重編程是一個很復(fù)雜的過程，把細(xì)胞核放進(jìn)一個卵子，這個卵子的環(huán)境是我們控制不了的。這就像我們把一個石頭扔到一個大海里面，這個石頭具體到了哪兒，將來流向哪里，我們是控制不了的，你也很難對它進(jìn)行有效干預(yù)?！?/p>

根據(jù)孫強(qiáng)的介紹，克隆猴主要有三個難點(diǎn)。首先是細(xì)胞核不易識別，“去核”難度大。其次，克隆過程中，體細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)入卵細(xì)胞時，需先“喚醒”卵細(xì)胞，然后才啟動一系列發(fā)育“程序”，但卵細(xì)胞容易提前激活。最后，體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育效率低，絕大多數(shù)克隆胚胎都難以正常發(fā)育，往往胎死腹中。

在孫強(qiáng)團(tuán)隊的研究中，團(tuán)隊最終利用猴胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植。最終將79枚克隆胚胎（處于二細(xì)胞期至囊胚期）移植入21只代孕母猴中，最終4只代孕成功的母猴有兩只流產(chǎn)，剩下兩只正常懷孕超過140天，然后通過剖腹產(chǎn)手段獲得兩只存活的猴，即“中中”和“華華”

“中中”和“華華”誕生的墊腳石

體細(xì)胞重編程的難以控制，使得動物克隆效率極為低下，長期停留在1%以下的水平。

對于此次克隆猴的成功，未曾走出國門留學(xué)、自稱“土鱉一代”的孫強(qiáng)率領(lǐng)的團(tuán)隊毫無疑問是功臣，其中諸多媒體爭相報道的即是論文第一作者劉真博士耗時3年訓(xùn)練的快速“去核”、“注核”的本事。

蒲慕明提到劉真時表示，“體細(xì)胞核移植技術(shù)流程非常關(guān)鍵，操作越快，卵細(xì)胞受損就會越小，劉博士在這方面做的很出色。劉真可能在10秒之內(nèi)對卵母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞去核操作，在15秒之內(nèi)將體細(xì)胞注入到卵母細(xì)胞當(dāng)中?！痹谄涯矫骱蛯O強(qiáng)的眼里，就細(xì)胞“去核”、“注核”技術(shù)，劉真是當(dāng)之無愧的“世界冠軍”。

對于孫強(qiáng)團(tuán)隊的成功，季維智表示，“顯微操作的時候技術(shù)熟練是條件之一，另一個成功的關(guān)鍵在于他們找到了體細(xì)胞去甲基化、乙?；暮线m配方?！闭劶绑w細(xì)胞的去甲基化、乙?；?，繞不開孫強(qiáng)團(tuán)隊成功的墊腳石。

體細(xì)胞甲基化、乙?；瘜?shí)際上都是體細(xì)胞重編程過程中的表觀遺傳修飾障礙。無論DNA、RNA還是蛋白質(zhì)，其表面均有例如甲基、乙?；鹊念~外基團(tuán)，這些基團(tuán)就被稱為“修飾”，它們受細(xì)胞狀態(tài)影響，也能反過來影響細(xì)胞狀態(tài)。

克服表觀遺傳修飾障礙的轉(zhuǎn)機(jī)出現(xiàn)在2014年。華裔科學(xué)家、美國哈佛醫(yī)學(xué)院教授張毅實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，在體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)中，組蛋白H3K9me3的修飾所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默是阻擋細(xì)胞重編程進(jìn)行的“屏障”，加入去甲基化酶Kdm4d就可以使得重編程效率大大增加。

隨后的2016年，上海同濟(jì)大學(xué)的高紹榮團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b能極大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率。而早在2006年，日本理化學(xué)研究所RIKEN的Wakayama團(tuán)隊則發(fā)現(xiàn)TSA能提高小鼠克隆效率，TSA就是一種乙?；敢种苿?。

賴良學(xué)表示，“在張毅的這項(xiàng)研究之前，各個實(shí)驗(yàn)室也都在想辦法進(jìn)行干預(yù)，但大都沒找到關(guān)鍵點(diǎn)?！倍揪S智上述提到的“合適配方”指的則是，孫強(qiáng)團(tuán)隊此番在體細(xì)胞核移植體系中找到了TSA和Kdm4d的理想濃度組合。

由此看來，“中中”和“華華”的誕生實(shí)際上并不是單個實(shí)驗(yàn)室的成果，更像是克隆領(lǐng)域近幾年發(fā)展的一項(xiàng)集成。高紹榮在點(diǎn)評該成果時也表示，“離不開科學(xué)家們長期以來對克隆胚胎重編程機(jī)制的研究”。也正是基于科學(xué)家近年來的突破性進(jìn)展，季維智才認(rèn)為，“克隆猴確實(shí)只是一個時間問題了?！?/p>

2000年后美國基本“偃旗息鼓”

中國此番獲得全球首例克隆猴，被稱為“彎道超車”。

曾經(jīng)克隆猴領(lǐng)域的領(lǐng)跑者當(dāng)屬美國。曾被科學(xué)界認(rèn)為最可能第一個克隆出猴子的即是美國俄勒岡靈長類研究中心的著名科學(xué)家美籍哈薩克斯坦科學(xué)家沙烏科萊特?米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）。

早在2007年，米塔利波夫團(tuán)隊在《自然》發(fā)表成果：利用細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)，成功用猴子皮膚細(xì)胞克隆出胚胎，并提取出兩個干細(xì)胞系。這是人類首次以體細(xì)胞克隆的方式獲得靈長類胚胎。

2010年，米塔利波夫率領(lǐng)團(tuán)隊更是成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎發(fā)育至81天，以流產(chǎn)告終。這也是在孫強(qiáng)團(tuán)隊完成克隆之前，全球離實(shí)現(xiàn)克隆猴距離最近的一項(xiàng)研究。

而在米塔利波夫之前，美國的科學(xué)家在2000年時曾宣布用胚胎分裂的方式對猴進(jìn)行克隆。研究人員把107個猴胚胎分裂成368個胚胎，結(jié)果有4個發(fā)育成熟但胎死腹中，只有一只在胚胎分裂157天之后幸運(yùn)地降生。這只也就是曾經(jīng)一度被稱為首次成功克隆獲得的靈長類動物“Tetra”。

但實(shí)際上，胚胎分裂方式并不是真正意義上的體細(xì)胞克隆，因此也未引起過多關(guān)注。

然而，除了米塔利波夫團(tuán)隊，美國在克隆研究的巔峰期之后又如何看待這項(xiàng)研究？季維智和賴良學(xué)都提及，“近十幾年來，美國已鮮有實(shí)驗(yàn)室研究克隆候?！?/p>

賴良學(xué)提及，Schatten在2000年左右提出的基于“多莉”的克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)克隆猴是“行不通的”，這無疑是給美國克隆研究“潑了冷水”。

“Schatten當(dāng)時用體細(xì)胞克隆，他認(rèn)為胚胎發(fā)育超越不了八細(xì)胞期（哺乳動物早期胚胎發(fā)育的一個階段）?！奔揪S智也同樣表示，“實(shí)際上，我們在2007年就把這個觀點(diǎn)否定掉了，我們當(dāng)時就發(fā)現(xiàn)是可以達(dá)到囊胚階段的。并且還證明了，跟正常的胚胎相比，克隆胚胎在八細(xì)胞期和二細(xì)胞期的時候確實(shí)是有很高的DNA甲基化水平?！痹擁?xiàng)研究由季維智和中科院動物所周琪團(tuán)隊合作完成，也是首次證明了克隆胚胎的甲基化水平異常。

針對克隆猴近十幾年來在美國遇冷的現(xiàn)象，賴良學(xué)認(rèn)為，“猴子畢竟是靈長類動物，成本很高，不像其它實(shí)驗(yàn)一樣，各種方法、技術(shù)都去試。如果一段時間試不出來，經(jīng)費(fèi)又用完了，很多實(shí)驗(yàn)室可能也就停掉了克隆實(shí)驗(yàn)?！?/p>

不過，在季維智看來，經(jīng)費(fèi)、甚至猴子資源都不是美國近十幾年來在克隆猴方面遇冷的根本原因?！斑@些有一定影響，但關(guān)鍵是美國的興奮點(diǎn)沒有放在克隆上面了，而是轉(zhuǎn)向了基因編輯等其他領(lǐng)域?！?/p>

此番克隆猴的出現(xiàn)，會在全球范圍內(nèi)再次迎來一場克隆巔峰嗎？答案拭目以待。不過，蒲慕明在成果發(fā)布之際曾提到，“基因編輯在胚胎克隆上有很多問題無法解決，比如脫靶等。但在體細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因編輯時，這些問題都比較容易解決。”