1872年，亨廷頓病由美國醫(yī)學(xué)家喬治?亨廷頓首次發(fā)現(xiàn)并因此命名?；疾≌邥?huì)表現(xiàn)出手舞足蹈狀，故又被稱為“致命的舞蹈”。

實(shí)際上，類似于阿爾茨海默癥（AD）、帕金森綜合征（PD）、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ASL）等，亨廷頓病是一種神經(jīng)退行性疾病。但和阿爾茨海默癥等疾病不同的是，亨廷頓病還是一種常染色體顯性遺傳疾病。這就意味著，只要父母一方患有疾病，子女就有50%的概率面臨相同的命運(yùn)，甚至世世代代難以逃脫“魔咒”。

目前，該疾病沒有有效治療方法，“看著他走向死亡”是患者家屬的最后心路。過去的20年時(shí)間里，藥企進(jìn)行了近百次臨床試驗(yàn)，研究了治療亨廷頓癥的41種不同組合藥物，但只有2種藥物獲得許可，并且只能緩解癥狀。

最新的進(jìn)展是，該疾病的大動(dòng)物模型成功建立。北京時(shí)間3月30日，生物學(xué)頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》（Cell）在線發(fā)表了中國科學(xué)家的一項(xiàng)重大成果：首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT），成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準(zhǔn)地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病。2個(gè)月以前，中國科學(xué)家獲得全球首個(gè)體細(xì)胞克隆猴的成果也發(fā)表在該期刊。

論文共同通訊作者為暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院李曉江教授、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)研究員、美國埃默里大學(xué)李世華教授。李曉江是亨廷頓病研究領(lǐng)域的權(quán)威，于2008年和李世華在世界上首次利用轉(zhuǎn)基因的方法建立了非人靈長類的亨廷頓疾病猴模型。賴良學(xué)則長期從事豬等大型哺乳動(dòng)物的克隆，2010年和李曉江、李世華合作建立了首例轉(zhuǎn)基因亨廷頓舞蹈病的豬模型。

賴良學(xué)在接受澎湃新聞（m.nxos.com.cn）采訪時(shí)表示，“過去長期存在的問題是，我們用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)試圖建立亨廷頓病的大動(dòng)物模型，但轉(zhuǎn)基因的缺點(diǎn)是基因插入位置無法控制、表達(dá)量也無法控制，因此此前轉(zhuǎn)基因克隆獲得的豬或者猴子都存活不了幾天，準(zhǔn)確來說無法稱之為模型?！?/p>

賴良學(xué)提到，2013年CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的問世，讓這項(xiàng)亨廷頓病動(dòng)物模型的研究工作出現(xiàn)曙光。研究團(tuán)隊(duì)再次投入了長達(dá)4年的時(shí)間，最終獲得這份成果。

著名的細(xì)胞生物學(xué)家、原同濟(jì)大學(xué)校長、中科院院士裴鋼表示，2008年，我們?cè)谥贫òl(fā)育與生殖研究國家重大科學(xué)研究計(jì)劃"十二五"專項(xiàng)規(guī)劃時(shí)，就前瞻性地布局了大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型包括豬和猴的培育內(nèi)容，并在后來的“干細(xì)胞國家重大科學(xué)研究計(jì)劃”中持續(xù)加大經(jīng)費(fèi)投入。

裴鋼評(píng)價(jià)，我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果，這次我國科學(xué)家在豬的疾病模型研究中又取得重大進(jìn)展，表明我國在大動(dòng)物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動(dòng)我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。

從事多年亨廷頓病研究的權(quán)威專家、美國加州大學(xué)洛杉磯分校楊向東教授也指出，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域中的一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，使科學(xué)家能更深入了解神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制及尋找有效的治療方法。

定點(diǎn)敲入人致病基因

亨廷頓病的病因是，患者體內(nèi)的亨廷頓基因外顯子1發(fā)生了CAG三核苷酸重復(fù)突變，進(jìn)而引發(fā)其編碼的亨廷頓蛋白（HTT）多聚谷氨酰胺（polyQ）序列延長所致。實(shí)際上，除亨廷頓病之外，多聚谷氨酰胺序列延長還會(huì)導(dǎo)致其他至少8種神經(jīng)退行性疾病，包括脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、脊髓延髓肌肉萎縮癥（肯尼迪病）等。

值得一提的是，亨廷頓病是由單基因突變導(dǎo)致的神經(jīng)退性疾病，這使之成為一個(gè)理想的疾病模式，可用于研究蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊如何引起選擇性的神經(jīng)退性病變，也是以后研究多基因突變病癥的基礎(chǔ)。

研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將人突變的亨廷頓基因，即人外顯子1中包含150 CAG重復(fù)序列精確地插入豬的亨廷頓蛋白內(nèi)源性基因中。研究團(tuán)隊(duì)通過PCR篩選了2430個(gè)融水胎兒豬成纖維細(xì)胞，最終確定了9個(gè)陽性克隆細(xì)胞。

研究團(tuán)隊(duì)挑選了其中一個(gè)細(xì)胞克隆株用于體細(xì)胞核移植，最終獲得2880個(gè)胚胎。這些胚胎被轉(zhuǎn)移至16頭代孕豬，其中10頭代孕豬懷孕成功，排除流產(chǎn)后獲得了7頭自然產(chǎn)下的小豬。

PCR基因型分析和DNA測序結(jié)果顯示，共有6頭豬攜帶了擴(kuò)展CAG重復(fù)的人類亨廷頓蛋白外顯子1。這6頭豬即被稱為F0代。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)用F0代母豬和野生型公巴馬香豬交配，獲得F1代豬。F1代公豬和野生型母巴馬香豬交配，獲得F2代豬。論文中數(shù)據(jù)顯示，過去的兩年時(shí)間里，研究團(tuán)隊(duì)通過這種繁殖方式，獲得了15頭F1代豬和10頭F2代豬，全都呈現(xiàn)突變亨廷頓蛋白陽性。

賴良學(xué)告訴澎湃新聞，“論文發(fā)表之后，還在繼續(xù)產(chǎn)生后代，現(xiàn)在所有的基因敲入豬加起來，差不多有近50頭了?！?p>

賴良學(xué)強(qiáng)調(diào)，“以前用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)進(jìn)去之后，豬本身的亨廷頓蛋白也在同時(shí)起作用，這次通過基因編輯敲入，豬本身基因是破壞掉的。這樣，豬本身的亨廷頓基因就不會(huì)表達(dá)了，純粹表達(dá)人致病基因。結(jié)果出來的癥狀、病理變化都是跟自然發(fā)生的是一致的。”

癥狀、病理與人類似

亨廷頓病主要特點(diǎn)是軀體和四肢不可控制地舞蹈樣運(yùn)動(dòng)，漸進(jìn)性認(rèn)知能力下降和精神障礙，主要病理特征則為大腦紋狀體區(qū)中型棘突神經(jīng)元（MSN）逐漸丟失。

論文中數(shù)據(jù)提到，截至論文最終版本，年齡最大的F0代為30個(gè)月，最大的F1是12個(gè)月，F(xiàn)2代則還是新生豬。因此，研究團(tuán)隊(duì)研究焦點(diǎn)主要放在F0代和F1代。

研究團(tuán)隊(duì)首先要確定，致病基因有沒有讓這些基因敲入豬表現(xiàn)出和人一致的年齡相關(guān)的神經(jīng)學(xué)癥狀，并且這些癥狀是否遺傳給后代。

一般來說，亨廷頓病患者發(fā)病多在35歲到50歲，表現(xiàn)為舞蹈樣癥狀、認(rèn)知和精神障礙?；颊呱掷m(xù)約10到20年，甚至有2-3年即去世的病例。令人惋惜的是，亨廷頓病發(fā)病時(shí)間一般已超過生育年齡，且為顯性遺傳，因此大多數(shù)患者都在發(fā)病前已“悄然”遺傳給下一代。

賴良學(xué)提到，“除非采用基因檢測，否則很難在沒有發(fā)病前意識(shí)到自己患病?！?/p>

研究結(jié)果顯示，基因敲入豬在4個(gè)月以前沒有表現(xiàn)出明顯癥狀，和同性別、同年齡野生型豬相比，體重增加也很少。

年齡較大的基因敲入豬皮膚則會(huì)有嚴(yán)重的褶皺和下垂。一些F0代基因敲入豬在5個(gè)月和10個(gè)月之間會(huì)過早死亡，也通常表現(xiàn)出走路畸形。這些癥狀都和人類相似。

賴良學(xué)介紹，“4個(gè)月以后，運(yùn)動(dòng)能力就開始受到一定的影響，正常走可能看不出來，但放到跑步機(jī)上，讓它使勁跑，它跑著跑著就不行，比正常的豬運(yùn)動(dòng)能力差?！闭撐闹刑岬?，用跑步機(jī)來觀察F0代豬的運(yùn)動(dòng)功能，結(jié)果顯示，一頭5個(gè)月大已經(jīng)表現(xiàn)出癥狀的基因敲入豬無法和正常對(duì)照組一樣運(yùn)動(dòng)，其他F0代豬也表現(xiàn)出類似的跑步困難。

值得一提的是，這頭5個(gè)月大的基因敲入豬在跑步機(jī)測試2天后即死亡了。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，這一點(diǎn)或許說明基因敲入豬難以承受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，呼吸衰竭可能是這頭豬死亡的直接原因。

而肺功能障礙和吸入性肺炎或窒息也可能是亨廷頓患者的主要死因。

另外，基因敲入豬表現(xiàn)出呼吸困難或者呼吸不規(guī)律。目前，呼吸困難只在基因敲入豬身上表現(xiàn)出來，此前在小鼠和其他動(dòng)物模型上均未看到。

除癥狀之外，這些基因敲入豬的大腦區(qū)域選擇性神經(jīng)病理學(xué)也和人類相似。病理學(xué)分析顯示，5個(gè)月大基因敲入豬大腦尺寸比同齡的野生型豬要小，大腦皮層的厚度和紋狀體的尺寸也更小。對(duì)5個(gè)月大的已有癥狀的基因敲入豬進(jìn)行MRI（核磁共振成像）分析也顯示出，它們的側(cè)腦室擴(kuò)大、紋狀體尺寸則減小。

另外，163個(gè)臨床案例顯示，相比殼核，紋狀體的尾狀核會(huì)提前發(fā)生退化。而5個(gè)月大的有癥狀的基因敲入豬的紋狀體也表現(xiàn)出一致的退化順序。

代代相傳、多因素決定能活多久

值得一提的是，此前研究團(tuán)隊(duì)用轉(zhuǎn)基因試圖建立的猴模型、豬模型，皆因表達(dá)外源性致病基因片段的毒性過強(qiáng)，出生不久后即死亡。而研究團(tuán)隊(duì)此番成果的重要性之一就在于實(shí)現(xiàn)了傳代。

研究結(jié)果顯示，F(xiàn)1代在基因表達(dá)、體重增加、早期死亡、運(yùn)動(dòng)困難、呼吸困難等方面都和F0代類似。這意味著，發(fā)生在亨廷頓病患者身上的“遺傳性”在基因敲入豬模型上也同樣實(shí)現(xiàn)。

賴良學(xué)表示，“和人一樣，這些豬也可以發(fā)育到性成熟（豬性成熟在5-6個(gè)月），可以有后代。2010年我們發(fā)過的文章是用轉(zhuǎn)基因豬，它的癥狀就太明顯了，表達(dá)量太高，所以生下來幾天就死了。李曉江教授在美國用的轉(zhuǎn)基因猴也一樣，也沒活下去。沒活下來就沒有用，并沒有形成這個(gè)動(dòng)物模型?！?/p>

不過有趣的是，基因型分析顯示，CAG重復(fù)并不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，在F0代中是130-150 CAGs，F(xiàn)1代是113-206 CAGs，F(xiàn)2代是118-230 CAGs。另外，在不同組織中CAG重復(fù)也是不一致的。

賴良學(xué)認(rèn)為，這或許是造成個(gè)體之間發(fā)病時(shí)間不一樣、發(fā)病輕重也不一樣的原因。

論文中還提到一個(gè)注意點(diǎn)，一頭含有206 CAGs的基因敲入豬比其它含有113-138 CAGs的幾頭豬壽命要長，這就暗示CAG重復(fù)長度并不是生命長短的唯一決定因素。

研究團(tuán)隊(duì)指出，環(huán)境壓力以及其他因素同樣能影響這些豬最終能活多久。

研究也確實(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)F1代的基因敲除豬采用“單間”飼養(yǎng)，也就是幫助它們減少環(huán)境壓力后，它們的壽命比F0代這些“群體”飼養(yǎng)的基因敲除豬要長。

值得一提的是，該項(xiàng)研究之所以被視為神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域中的一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵一點(diǎn)還在于此前經(jīng)常使用的模型為小鼠等嚙齒類動(dòng)物，而種間差異實(shí)際上是一道很大的研究鴻溝。

論文中指出，盡管亨廷頓癥小鼠模型在突變亨廷頓蛋白方面表現(xiàn)出和年齡相關(guān)的累積，以及其他一些神經(jīng)學(xué)癥狀，但基因敲入亨廷頓小鼠缺乏明顯的神經(jīng)退行性，而這正是亨廷頓病經(jīng)典的病理學(xué)標(biāo)記。

當(dāng)然，和非人靈長類動(dòng)物模型相比，豬和人類要遠(yuǎn)一些。但豬模型的明顯優(yōu)勢在于，繁殖周期快（5-6個(gè)月即能性成熟）、一胎產(chǎn)仔量大（平均7-8頭小豬）。賴良學(xué)舉例表示，“以后也可以用類似的方法建立猴子模型，但通過猴子模型觀察和年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性癥狀，以及利用它傳代再觀察后代，這將是一個(gè)很長的周期?！?/p>