生命科學(xué)

Life science

免疫檢查點(diǎn)療法雖已革新癌癥治療格局，但在肝細(xì)胞癌中的客觀緩解率仍不足30%，其核心障礙在于腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷的內(nèi)在抵抗以及腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)。盡管已有研究報(bào)道了部分免疫逃逸調(diào)控分子，但肝細(xì)胞癌免疫耐受的分子網(wǎng)絡(luò)仍缺乏系統(tǒng)認(rèn)知。

基于此，近日，來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科的科學(xué)團(tuán)隊(duì)在Cell Press細(xì)胞出版社旗下期刊Cancer Cell上在線發(fā)表了一篇題為“Targeting tumor-intrinsic STK40 induces immune vulnerability and drives T cell reinvigoration”的研究性論文。文章通過(guò)體內(nèi)CRISPR篩選技術(shù)，鑒定出絲氨酸/蘇氨酸激酶40（STK40）作為肝細(xì)胞癌免疫逃逸的關(guān)鍵調(diào)控樞紐，并系統(tǒng)闡明了靶向STK40如何同時(shí)解除腫瘤內(nèi)在抵抗與外在免疫抑制的雙重屏障。

研究人員首先構(gòu)建了涵蓋566個(gè)激酶基因的小鼠全激酶組CRISPR敲除文庫(kù)，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至穩(wěn)定表達(dá)Cas9和卵清蛋白的Hepa1-6肝癌細(xì)胞系中。通過(guò)將攜帶該文庫(kù)的腫瘤細(xì)胞分別移植至免疫缺陷的Rag1敲除小鼠和經(jīng)OVA預(yù)免疫的免疫正常小鼠（聯(lián)合或不聯(lián)合抗PD-1治療），研究者篩選出在免疫選擇壓力下顯著耗竭的基因。在所有三個(gè)免疫選擇條件比較中，有15個(gè)基因出現(xiàn)一致性耗竭，其中STK40是耗竭最顯著的基因。值得注意的是，已知的免疫逃逸相關(guān)基因如Ptpn2、Cop1、Ctnnb1等同樣出現(xiàn)在這一列表中，驗(yàn)證了篩選策略的可靠性。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性體內(nèi)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，研究者證實(shí)Stk40缺失的腫瘤細(xì)胞在免疫正常小鼠中生長(zhǎng)顯著受損，但在免疫缺陷小鼠中卻與對(duì)照細(xì)胞無(wú)差異，說(shuō)明Stk40對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控完全依賴于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的存在。更為重要的是，當(dāng)聯(lián)合抗PD-1治療時(shí)，Stk40缺陷腫瘤可實(shí)現(xiàn)完全消退，且治愈小鼠能夠抵抗腫瘤的再次挑戰(zhàn)，表明其建立了持久的免疫記憶。在水動(dòng)力尾靜脈注射誘導(dǎo)的自發(fā)性肝癌模型中，Stk40缺失同樣顯著抑制了腫瘤進(jìn)展并延長(zhǎng)了小鼠生存期，而且在肝細(xì)胞特異性Stk40敲除小鼠中，無(wú)論是Myc/Trp53雙突變還是Myc/β-catenin激活突變均無(wú)法誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，所有小鼠均實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期無(wú)瘤生存。

為了明確介導(dǎo)這一效應(yīng)的免疫細(xì)胞亞群，研究者通過(guò)抗體清除實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞是Stk40缺陷腫瘤免疫監(jiān)視的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，清除CD8陽(yáng)性T細(xì)胞可完全逆轉(zhuǎn)Stk40缺陷導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)抑制。進(jìn)一步利用OT-I T細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行的體內(nèi)CRISPR篩選再次確認(rèn)了Stk40是抵抗CD8陽(yáng)性T細(xì)胞殺傷的重要基因。體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，Stk40缺陷的肝癌細(xì)胞在與活化OT-I細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)被選擇性清除，而這種效應(yīng)在加入中和性IFN-γ抗體后完全消失，提示IFN-γ信號(hào)通路的關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，只有在CD8陽(yáng)性T細(xì)胞存在的情況下，Stk40缺陷的腫瘤細(xì)胞才會(huì)出現(xiàn)IFN反應(yīng)基因特征的顯著富集，而在沒(méi)有T細(xì)胞壓力時(shí)并無(wú)此現(xiàn)象，這明確表明Stk40缺失使腫瘤細(xì)胞對(duì)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞來(lái)源的IFN-γ更為敏感。

機(jī)制研究方面，既往文獻(xiàn)報(bào)道STK40可作為假激酶與E3泛素連接酶COP1結(jié)合，為底物蛋白的泛素化降解提供支架。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)STK40與COP1及IFNGR1存在物理相互作用，而且STK40是COP1與IFNGR1形成復(fù)合物所必需的銜接蛋白。Stk40缺失導(dǎo)致IFNGR1蛋白水平升高而mRNA水平不變，反之過(guò)表達(dá)Stk40則降低IFNGR1蛋白豐度并促進(jìn)其多聚泛素化降解。蛋白酶體抑制劑MG132處理可阻斷Stk40過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的IFNGR1下降，而Cop1敲除則完全消除Stk40對(duì)IFNGR1的調(diào)控作用。這些數(shù)據(jù)揭示了STK40-COP1復(fù)合物通過(guò)促進(jìn)IFNGR1泛素化降解來(lái)削弱腫瘤細(xì)胞對(duì)IFN-γ反應(yīng)的分子機(jī)制。功能挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在Stk40缺陷細(xì)胞中同時(shí)敲除Ifngr1可完全逆轉(zhuǎn)其對(duì)OT-I細(xì)胞的敏感性并恢復(fù)腫瘤生長(zhǎng)能力，在肝細(xì)胞特異性Stk40敲除小鼠中，Ifngr1缺失也顯著削弱了Stk40缺失抑制腫瘤發(fā)生的效果。

除了增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞殺傷的敏感性外，研究還發(fā)現(xiàn)Stk40缺失重塑了腫瘤免疫微環(huán)境。單細(xì)胞RNA測(cè)序分析顯示，Stk40缺陷腫瘤中CD8陽(yáng)性T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加，且CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的效應(yīng)功能增強(qiáng)而耗竭狀態(tài)減輕。特別值得注意的是，傳統(tǒng)I型樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC1）在Stk40缺陷腫瘤中出現(xiàn)了顯著擴(kuò)增。通過(guò)CellPhoneDB細(xì)胞互作分析，研究者發(fā)現(xiàn)Stk40缺陷腫瘤中樹(shù)突狀細(xì)胞與CD8陽(yáng)性T細(xì)胞之間的通訊網(wǎng)絡(luò)明顯增強(qiáng)，同時(shí)cDC1表面遞呈OVA抗原肽SIINFEKL的MHC-I復(fù)合物水平升高，腫瘤中OVA特異性CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的頻率也相應(yīng)增加。為了驗(yàn)證cDC1的功能必要性，研究者將腫瘤細(xì)胞接種至Batf3敲除小鼠（該小鼠缺乏cDC1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Stk40缺失帶來(lái)的腫瘤生長(zhǎng)抑制、生存獲益以及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞富集效應(yīng)在Batf3敲除小鼠中均被完全消除，證實(shí)cDC1是Stk40缺失誘導(dǎo)抗腫瘤免疫所必需的細(xì)胞群體。

為了闡明Stk40缺失如何促進(jìn)cDC1在腫瘤微環(huán)境中的富集與活化，研究者檢測(cè)了Stk40缺陷細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜。轉(zhuǎn)錄組和細(xì)胞因子芯片分析一致發(fā)現(xiàn)，GM-CSF（由Csf2基因編碼）在Stk40缺陷細(xì)胞中顯著上調(diào)，而GM-CSF正是cDC1分化與活化所必需的關(guān)鍵細(xì)胞因子。通過(guò)構(gòu)建Stk40與Csf2雙敲除細(xì)胞，研究者證實(shí)Csf2缺失可顯著逆轉(zhuǎn)Stk40缺陷導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)抑制以及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞和cDC1的浸潤(rùn)增加。利用Csf2rb（GM-CSF受體β亞基）全身敲除或cDC1特異性敲除小鼠，研究者進(jìn)一步證明，腫瘤來(lái)源的GM-CSF通過(guò)作用于cDC1來(lái)介導(dǎo)Stk40缺陷引發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。機(jī)制上，研究者發(fā)現(xiàn)Stk40缺失導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路的活化，p65亞基磷酸化水平升高，而敲除p65則顯著降低了Csf2的表達(dá)，表明Stk40通過(guò)負(fù)調(diào)控NF-κB來(lái)抑制GM-CSF的產(chǎn)生。

在治療轉(zhuǎn)化方面，由于全身性Stk40敲除小鼠存在圍產(chǎn)期致死性，研究者首先構(gòu)建了他莫昔芬誘導(dǎo)的Stk40條件性敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)成年期誘導(dǎo)Stk40缺失耐受性良好，無(wú)明顯器官病理改變，僅雄性小鼠有輕度體重下降。針對(duì)已建立的腫瘤，通過(guò)AAV8-TBG-Cre在成瘤后誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性Stk40敲除，仍能顯著抑制腫瘤進(jìn)展并延長(zhǎng)生存期?？紤]到缺乏STK40的小分子抑制劑，研究者開(kāi)發(fā)了脂質(zhì)納米顆粒包裹的Stk40 siRNA（LNP-siStk40）。在皮下移植瘤模型中，瘤內(nèi)注射LNP-siStk40聯(lián)合抗PD-1治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)并增加了CD8陽(yáng)性T細(xì)胞和cDC1的浸潤(rùn)。在自發(fā)性肝癌模型中，靜脈全身給藥同樣實(shí)現(xiàn)了顯著的腫瘤抑制和生存延長(zhǎng)，且與抗PD-1治療表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。更重要的是，在患者來(lái)源的肝癌類器官與PBMC共培養(yǎng)體系中，LNP-siSTK40處理上調(diào)了IFNGR1表達(dá)和GM-CSF分泌，并降低了類器官的活力；在PBMC人源化的PDX小鼠模型中，LNP-siSTK40同樣有效抑制了腫瘤生長(zhǎng)。最后，研究者驗(yàn)證了STK40的免疫調(diào)控功能具有跨癌種的保守性，在結(jié)直腸癌、胰腺癌和乳腺癌模型中，Stk40缺失均增強(qiáng)了抗腫瘤免疫，而LNP-siStk40與抗PD-1聯(lián)合治療在這些模型中同樣取得了顯著的腫瘤抑制效果。

綜上所述，這項(xiàng)研究通過(guò)系統(tǒng)的體內(nèi)CRISPR篩選和深入的機(jī)制解析，將STK40確立為腫瘤免疫逃逸的核心調(diào)控因子。STK40一方面作為COP1的銜接蛋白促進(jìn)IFNGR1的泛素化降解，削弱腫瘤細(xì)胞對(duì)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞來(lái)源IFN-γ的敏感性；另一方面通過(guò)抑制NF-κB通路限制GM-CSF的產(chǎn)生，阻礙cDC1的募集與活化。靶向STK40能夠同時(shí)解除這兩個(gè)層面的免疫抵抗，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)在層面恢復(fù)其對(duì)T細(xì)胞殺傷的敏感性，在腫瘤微環(huán)境外在層面增強(qiáng)cDC1介導(dǎo)的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞活化。LNP-siRNA介導(dǎo)的STK40抑制在多種臨床前模型中與抗PD-1治療協(xié)同發(fā)揮強(qiáng)效抗腫瘤作用，且具有良好的耐受性，為克服肝癌乃至多種實(shí)體瘤的免疫治療抵抗提供了極具前景的雙功能治療靶點(diǎn)。

論文標(biāo)題：

Targeting tumor-intrinsic STK40 induces immune vulnerability and drives T cell reinvigoration

▌?wù)撐木W(wǎng)址：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1535610826002230

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2026.05.001

原標(biāo)題：《Cancer Cell：靶向腫瘤內(nèi)源性STK40可增加腫瘤免疫敏感性，并驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞功能重塑 | Cell Press論文速遞》

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