原創(chuàng) Cao Holmes PingWest品玩

臨床上靠的是綜合診斷，而不是靠單獨某一個臨床表現(xiàn)。

根據(jù)官方通報的數(shù)據(jù)，新型冠狀病毒肺炎（NCP）目前仍然有大量疑似病例尚未確診。而與此相對應(yīng)的另一組數(shù)據(jù)顯示，截至2月1日全國范圍內(nèi)病毒核酸檢測試劑盒日產(chǎn)量可達(dá)77.3萬份。理論上的“基本滿足檢測需求”，與實際情況的出入令人困惑。

同時，全國范圍內(nèi)還出現(xiàn)了多次經(jīng)核酸檢測試劑盒檢測為陰性、但最終證實為陽性的病例，一時間外界又對核酸檢測試劑盒的可靠性產(chǎn)生了疑慮。

“強烈推薦CT影像作為目前新冠肺炎首選診斷方法”，武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科副主任張笑春教授曾在朋友圈留言，“病毒核酸檢測是最終確診NCP無創(chuàng)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而‘CT陽性、核酸陰性’的檢測結(jié)果，可能會影響臨床排查。目前核酸檢測特異性高、敏感性偏低，不排除存在部分假陰性。”

隨后2月5日更新的NCP診療方案（試行第五版）中，“疑似病例具有肺炎CT影像學(xué)特征者”首次列為湖北省臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn)。

這些都讓我們對核酸檢測試劑產(chǎn)生好奇。它的原理是什么？影響病毒檢測的因素有哪些？目前NCP疑似病例確診的方法包含哪些？病毒核酸檢測試劑盒究竟靠不靠譜？

病毒核酸檢測原理簡析

在自然界中，病毒主要分為兩大類，RNA病毒和DNA病毒，新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬于前者。

RNA病毒在傳播過程中擁有自我復(fù)制和逆轉(zhuǎn)錄兩種復(fù)制方式。由于在其復(fù)制過程中，用于錯誤修復(fù)機制的酶的活性很低，因此其變異很快。但疫苗的研制卻需要根據(jù)病毒的固定基因或蛋白進(jìn)行，這也是當(dāng)年SARS疫苗遲遲未研發(fā)成功的重要原因。

幸運的是，至少到目前新型冠狀病毒尚未發(fā)生變異，并且已經(jīng)第一時間檢測出病毒基因序列，這將加速當(dāng)下疫苗的研發(fā)進(jìn)度。同時，由于普通RNA病毒對外部環(huán)境的抵抗力普遍比DNA病毒弱，因此治愈起來更為容易。當(dāng)然也有例外，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒——艾滋病病毒（HIV）的治愈就極其困難。

那么RNA病毒感染人體后如何進(jìn)行檢測呢？目前常見的RNA病毒檢測方法是基于逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RT-PCR）實現(xiàn)的，這也是目前主要NCP核酸檢測試劑所使用的“實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法”的基本原理。

簡單來說，新型冠狀病毒存在有特異性的基因序列，我們利用能夠識別這些基因序列的引物探針去做real-time RT-PCR，即實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，它能夠放大擴(kuò)增特定DNA片段，如果反應(yīng)后有目標(biāo)基因序列擴(kuò)充出來，則檢測結(jié)果判斷為陽性，即存在病毒。當(dāng)然，這其中會出現(xiàn)誤差，后文會具體解釋。

據(jù)了解，目前疑似病例提取樣本檢測主要包含采集、滅活、核酸提取、PCR擴(kuò)增、試劑反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)，檢測過程環(huán)節(jié)多，風(fēng)險高。樣本運輸需要過程，而樣本的信息錄入也需要很大的工作量，反應(yīng)敏度控制也會影響檢測時長。

一般而言，一例病毒樣本送達(dá)實驗室后需要4到6小時才能獲得檢測結(jié)果，其中核酸提取時間約為七八十分鐘，而PCR擴(kuò)增反應(yīng)則需要一個半小時。

檢測過程復(fù)雜、運輸過程耗時、以及符合條件的實驗室稀缺，諸多因素是導(dǎo)致目前病毒核酸檢測試劑盒產(chǎn)量充足、卻無法完全實現(xiàn)全部疑似病例檢測的重要原因。不過，從目前來看，這一狀況正在逐漸得到改善，確診病例的明顯增長便是重要佐證。

“確診病例出現(xiàn)明顯增長首先是因為檢測能力的提升，越來越多符合條件的實驗室加入到檢測機構(gòu)行列中。同時，早期開展檢測的實驗室也通過多種方法擴(kuò)大檢測能力”，武漢華中科大同濟(jì)醫(yī)院分子診斷與遺傳學(xué)實驗室孫自鏞主任在接受央視記者采訪時表示。目前，華中科大同濟(jì)醫(yī)院每日核酸檢測能力是1000到1200例新型冠狀病毒樣本。

為了加快疑似病例的確認(rèn)工作，包括華中科大同濟(jì)醫(yī)院分子診斷與遺傳學(xué)實驗室在內(nèi)的諸多病毒檢測實驗室均實行“換人不換崗”的制度，24小時聯(lián)動進(jìn)行病毒檢測。

在2月7日召開的湖北省第十七場疫情防控例行發(fā)布會上，武漢市委常委、常務(wù)副市長胡亞波表示，目前武漢市可開展核酸檢測的機構(gòu)已擴(kuò)展至35家，每天的檢測能力從200份增加到了6000-8000份，并將繼續(xù)努力提升檢測能力。

病毒核酸檢測不是“萬能”的

2月8日上午，“出現(xiàn)咽拭子核酸檢測三陰感染者”話題登上微博熱搜，而此前也有諸多患者在經(jīng)過多達(dá)四次病毒核酸檢測才最終確診，這令我們對“狡猾”的病毒有了新的擔(dān)憂——病毒核酸檢測試劑盒究竟靠不靠譜。

“一般而言，核酸檢測是目前最準(zhǔn)確的診斷方法”，一位行業(yè)專家告訴PingWest品玩，“目前核酸檢測出現(xiàn)假陰性患者主要包含兩方面原因，一是采樣時沒有采集到病毒，二是核酸檢測試劑盒的靈敏度（真陽性率，即準(zhǔn)確檢測出相應(yīng)病人的概率）不高造成的?！?/p>

病毒沒有采集到容易理解，比如在咽拭子采樣過程中，由于病人比較難受導(dǎo)致采樣深度不夠，從而無法采集到有病毒的樣本，又或者是患者為輕癥患者或者是初期感染者，RNA病毒尚未“出現(xiàn)”在咽部，亦或是“敏感度”較低。

對此，國家醫(yī)療專家組成員、北京地壇醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心首席專家李興旺曾在2月4日的國家衛(wèi)健委發(fā)布會上表示，“目前核酸檢測的方法還是比較敏感的，有很多影響因素，比如采取標(biāo)本的規(guī)范化程度、時間、檢測手段等問題，這也是目前沒有把核酸檢測放開去做的重要原因?！?/p>

同時，李興旺也提示醫(yī)生和護(hù)士要規(guī)范地采集標(biāo)本。李興旺認(rèn)為，從呼吸道標(biāo)準(zhǔn)來講，肺泡灌洗液對于試劑盒的敏感性要高于痰的結(jié)果，痰的敏感度又要高于咽部的，所以越是危重病人診斷率越高，這是因為能采到肺泡灌洗液。接下來，更好的辦法是普通病人更多用痰做檢測，這樣可能會把陽性率進(jìn)一步提高。

其次，核酸檢測試劑盒的靈敏度也會影響檢測結(jié)果。據(jù)相關(guān)媒體報道，當(dāng)前市場上有96家企業(yè)相繼推出病毒核酸檢測試劑盒，然而截至目前，僅有7款產(chǎn)品獲得國家藥監(jiān)局應(yīng)急審批，其中6款采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法。

“影響試劑盒精確度的因素太多，光是檢測靶點，被世界衛(wèi)生組織推薦的就有6套，即便使用同一套檢測靶點，也會因試劑盒的成分組成差異導(dǎo)致生化反應(yīng)存在細(xì)微差別，此外，酶、離子用量和溶液、底物濃度配比都會影響試劑盒的靈敏度，這也是對廠家技術(shù)實力的考驗”，中科院半導(dǎo)體研究所研究員任魯風(fēng)曾經(jīng)告訴《商學(xué)院》記者。

“目前國內(nèi)對試劑盒的評價標(biāo)準(zhǔn)主要是通過臨床對比實驗來看檢測效果，就新型冠狀病毒而言，只有陰性陽性符合性標(biāo)準(zhǔn)，并無試劑原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，配方也只規(guī)定了組成成分，并不規(guī)定具體比例，公開標(biāo)準(zhǔn)也均是推薦性，而非強制性，因為這些標(biāo)準(zhǔn)其實并無必要去統(tǒng)一，這更多是技術(shù)問題，也是市場機制下優(yōu)勝劣汰的一部分”，任魯風(fēng)補充道。

除了假陰性，還存在與之對應(yīng)的“假陽性”。這背后的主要原因是由于樣本或者核酸檢測試劑盒被污染所致?！皹颖颈旧淼奈廴?、檢測試劑盒的探針引物和酶的污染、運輸途中的污染、缺少嚴(yán)格控制條件的實驗室環(huán)境、以及不專業(yè)的檢測操作，都會導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)”，行業(yè)專家對PingWest品玩表示，“這也是確診病例有核減的原因之一?！?/p>

目前，一些核酸檢測試劑盒生產(chǎn)商已經(jīng)將病毒檢測位位點擴(kuò)增至6到7個基因，同時對序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，相比初期的2個基因位點會更加精準(zhǔn)。同時，隨著越來越多符合條件的實驗室的加入，以及檢測標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，病毒核酸檢測也變得愈加精準(zhǔn)。

國家藥監(jiān)局器械注冊司稽查專員江德元表示，針對近期國家藥監(jiān)局審批的7家企業(yè)的核酸檢測產(chǎn)品，相關(guān)產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性可以得到保障。

患者確診靠的是綜合診斷

“任何病毒的核酸檢測檢出率都不可能是百分之百，對新型冠狀病毒的核酸檢測也不例外，它檢出假陰性也是在所難免，同時檢測檢出率的結(jié)果也和患者本身病情輕重程度、疾病發(fā)展的不同階段、取樣采樣的方式方法和實驗室自身的檢測條件等多種因素相關(guān)”，北京大學(xué)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科主任高占成在2月9日國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機制新聞發(fā)布會上表示。

“對于確診新冠肺炎，核酸檢測是一個不可或缺的手段，要是檢測結(jié)果為陽性，我們可以確診為新冠肺炎。如果初次檢測結(jié)果陰性的屬于疑似病例患者，按照衛(wèi)生健康委現(xiàn)行診療方案的要求，需要在定點醫(yī)院進(jìn)行隔離治療，嚴(yán)格觀察?！?/p>

在2月5日更新的NCP診療方案（試行第五版）中，“疑似病例具有肺炎CT影像學(xué)特征者”首次作為湖北省臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn)。

據(jù)了解，由于目前NCP的流行正與流感季重疊，而兩個疾病臨床表現(xiàn)有非常類似，因此目前很多確診病例的診斷主要是根據(jù)明確的流行病學(xué)史。目前，如果患者有明確的流行病學(xué)史，加上CT影像表現(xiàn)和核酸檢測，一般臨床診斷便沒有問題?！芭R床上靠的是綜合診斷，而不是靠某一個臨床表現(xiàn)”，北京佑安醫(yī)院感染綜合科主任梁連春在接受媒體采訪時表示。

此外，目前全國范圍內(nèi)出現(xiàn)了個別無癥狀感染者，由于其無臨床表現(xiàn)，所以只能通過核酸試劑盒進(jìn)行檢測。同時，也有部分患者此前3次肺部CT影像均無問題。

因此，從目前來看，NCP疑似病例確診仍然以流行病學(xué)史和核酸檢測結(jié)果為主。如果臨床表現(xiàn)和肺部CT影像都與NCP非常類似，核酸多次檢測均為陰性，該患者也會按照確診病例來管理。

圖片來自互聯(lián)網(wǎng)

*本文版權(quán)歸“PingWest品玩”公眾號所有，未經(jīng)授權(quán)嚴(yán)禁轉(zhuǎn)載。

原標(biāo)題：《“假陰性”頻現(xiàn)，病毒核酸檢測還靠譜么？》

閱讀原文